牛奶是日常中常用的食品，牛奶中有時(shí)也會(huì)有抗生素。如何檢出抗生素呢？方法如下：
1、微生物檢測法：
微生物檢測法是應(yīng)用較廣泛的方法，其測定原理是根據(jù)抗生素對微生物的生理機(jī)能、代謝的抑制作用,來定性或定量確定樣品中抗微生物藥物殘留，如紙片法（PD）、TTC法、拭子法（STOP）等。采用傳統(tǒng)的微生物檢測方法，缺點(diǎn)是：（1）時(shí)間長；（2）顯色狀態(tài)判斷通過肉眼辨別，易產(chǎn)生誤差，對微紅色者無法做出準(zhǔn)確判斷；（3）操作復(fù)雜。優(yōu)點(diǎn)是費(fèi)用低，一般實(shí)驗(yàn)室都能操作。其中， 紙片法和TTC法是牛奶中藥物殘留檢測的兩種常用的微生物檢測法。
1.1紙片法：
紙片法，即PD法（Paper Disc）。常用的紙片法有枯草桿菌紙片法和嗜熱脂肪桿菌紙片檢測法。這兩種方法主要用來檢測牛奶中的β－內(nèi)酰胺類抗生素，其操作過程基本相同，而選用的菌種不同?？莶輻U菌紙片法檢測的結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，為了確定陽性物質(zhì)是否為青霉素（或β－內(nèi)酰胺類），對加熱后的乳樣用青霉素酶處理，以滅活乳樣中的青霉素。然后再行檢測，檢測限可達(dá)0.01 IU/mL。而嗜熱脂肪桿菌紙片檢測法不僅用于檢測奶樣中β－內(nèi)酰胺類抗生素，并能暗示是否還存在其它抑菌物質(zhì)，檢測限可達(dá)0.008 IU/mL以下。一般在4h內(nèi)即可獲得結(jié)果。因此，在實(shí)踐中嗜熱脂肪桿菌紙片法比枯草桿菌紙片法應(yīng)用更為廣泛。此外，神保勝彥（1991）對紙片法作了進(jìn)一步研究和改進(jìn)。改進(jìn)后的紙片法不僅能夠確定抗生素的種類，而且提高了檢出率和準(zhǔn)確性，氯霉素最低檢出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，鏈霉素1mg/kg，紅霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。
1.2 TTC法：
TTC法，即氯化三苯基四氮唑法（ tripheye tetrazolium chloride），是目前我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢查牛乳中抗生素殘留的檢測方法（GB5409—85）。該法簡便、快速，無需特殊設(shè)備，3～4h可見報(bào)告，很適合牧場、乳品廠及食品衛(wèi)生檢測部門采用。檢測各種抗生素所用的TTC法試驗(yàn)的靈敏度（最低檢出量）分別為：青霉素0.004 U/mL，鏈霉素0.5 U/mL，慶大霉素0.4 U/mL，卡那霉素5 U/mL。
目前趨向研究更為靈敏、準(zhǔn)確、簡便、快速的微生物檢測方法。如美國和加拿大，使用拭子法和牛的抗生素和磺胺實(shí)驗(yàn)法（CAST）。此外，美國近年來補(bǔ)充的一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)方法－快速抗生素篩選法（FAST）。 盡管這些快速微生物檢測法有時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些假陽性，但在某種程度上是允許的；如產(chǎn)生這類情況，可進(jìn)一步做確證實(shí)驗(yàn)。
2、理化檢測法：
理化檢測方法是利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來測定其含量，如高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法、聯(lián)用技術(shù)等等，能進(jìn)行定性、定量和藥物鑒定，敏感性較高，但有的檢測程序較復(fù)雜，有的檢測費(fèi)用較高。在牛奶中抗生素殘留檢測方面，最常用的理化檢測方法是高效液相色譜和聯(lián)用技術(shù)。
2.1高效液相色譜
高效液相色譜（HPLC）是目前廣泛應(yīng)用的一種理化檢測方法，它引入了氣相色譜理論，在技術(shù)上采用了高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測器，實(shí)現(xiàn)了分離速度快、效率高和操作自動(dòng)化。幾乎所有的化合物包括高極性／離子型待測物和大分子物質(zhì)，均可用HPLC進(jìn)行測定。HPLC的分離機(jī)制與常規(guī)柱色譜相同，但填料更加精細(xì)（ф 5～10μm），需高壓泵推動(dòng)，柱效高（105塔板／m），速度快，靈敏度與GC相近。與GC相比，HPLC流動(dòng)相參與分離機(jī)制，其組成、比例和pH值等可靈活調(diào)節(jié)，如離子對色譜、膠束色譜、手性分離色譜等，使許多極難分離的待測物得以分析。反相HPLC發(fā)展最快，目前已成為大多數(shù)抗生素殘留的常規(guī)分析方法。主要原因是：（1）化學(xué)鍵合固定相（C18或C8）性質(zhì)穩(wěn)定，不淋失；（2）使用水、甲醇或乙腈等水溶性有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，不干擾紫外檢測，成本低；（3）樣品中極性雜質(zhì)先流出，只需待測物出峰后即可重復(fù)進(jìn)樣，分析速度快。
最常用的檢測方式為濃度型的紫外檢測器和熒光檢測器。紫外檢測器（UVD）最普及，其次是熒光檢測器和電化學(xué)檢測器（EChD）。由于奶樣中藥物殘留量少，背景干擾往往很嚴(yán)重，因此一般都通過柱前衍生反應(yīng)來提高紫外檢測器檢測殘留的靈敏度。彭莉等報(bào)道了用高效液相色譜法（HPLC）檢測牛奶中氯霉素的殘留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中殘留的氯霉素，用紫外檢測器在278nm檢測樣品。平均加收率94.8％，變異系數(shù)< 12.0％。此方法樣品前處理簡單、回收率高、實(shí)用性強(qiáng)、檢驗(yàn)靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可作為牛奶中氯霉素殘留檢測的確證方法。由于大部分抗生素在高于230nm的光譜區(qū)無吸收，而在低于230nm的紫外區(qū)許多樣本基質(zhì)和流動(dòng)相產(chǎn)生干擾，需衍生化后測定，限制了紫外檢測器的應(yīng)用。但是，大部分抗生素是手性分子，因此旋光檢測器有很大發(fā)展?jié)摿ΑＰ鈾z測有以下特點(diǎn)：（1）選擇性高，樣本僅需簡單提取即可；（2）靈敏度高，利用He－He激光作光源，靈敏度可達(dá)5～10uα水平；（3）可同時(shí)得到流出組分的比旋度[α]，用以定性。目前，該方法已用于紅霉素、慶大霉素、羧芐青霉素和吩羧青霉素殘留的測定。
此外，光二極管陣列檢測器（DAD）是近10年來HPLC最重要的突破。DAD可同時(shí)接收整個(gè)光譜區(qū)的信息，在色譜峰流出同時(shí)能進(jìn)行每個(gè)瞬間的動(dòng)態(tài)光譜掃描并快速采集信號，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后得到色譜—光譜的三維圖譜，信息量大大增加。一次進(jìn)樣可得到每個(gè)組分峰的定量、定性和純度信息，靈敏度亦明顯提高。
2.2聯(lián)用技術(shù)
各種分析技術(shù)聯(lián)用是現(xiàn)代獸藥殘留分析乃至整個(gè)分析化學(xué)方法上的發(fā)展特點(diǎn)。計(jì)算機(jī)的應(yīng)用加速了這一趨勢。聯(lián)用技術(shù)可揚(yáng)長避短，一般集分離、定量和定性（分子結(jié)構(gòu)信息）于一體，因而特別適用于確證性分析。常見的聯(lián)用技術(shù)，有TLC－MS、GC－MS、LC－MS、CZE－MS、LC－NMR、SFC－MS等。TLC－MS是最簡單的離線聯(lián)用技術(shù)。GC－MS已相當(dāng)成熟，應(yīng)用相對較多。但這些聯(lián)用儀價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)不如HPLC或GC那樣普及。
MS無疑可作為HPLC的通用型檢測器。使用微型柱（15×0.3cm id）和適宜的接口技術(shù)，如熱噴霧（TSP）、微粒束（PB）等解決了LC與MS的連接問題；使用軟電離技術(shù)，如快原子轟擊（FAB）、場解吸（FD）等解決了難氣化物質(zhì)的離子化問題。LC－MS現(xiàn)在已進(jìn)入實(shí)用階段，其靈敏度較熒光檢測器高1個(gè)數(shù)量級，能方便地對ng級的獸藥殘留組分進(jìn)行檢測與結(jié)構(gòu)確證。LC－NMR還可提供待測物立體化學(xué)方面的信息。
LC/MS是除GC/MS之外的一種集高效分離和多組分定性、定量于一體的系統(tǒng)。LC/MS對高沸點(diǎn)、不揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的化合物分離和鑒定具有獨(dú)特的優(yōu)勢。色/質(zhì)聯(lián)用法由于實(shí)現(xiàn)了高效層析分離和檢測聯(lián)機(jī)，可用微電腦控制層析條件、程序和數(shù)據(jù)處理，其特異性、靈敏度和重復(fù)性均好，并可一次同時(shí)完成同一樣本中多種藥物及其代謝物檢測。其分析方式有直接探頭分析法、直接液體導(dǎo)入法、GC/MS、LC/MS聯(lián)用法等。使用電子轟擊離子化、化學(xué)電離、快速原子轟擊、熱噴霧電離、等離子體噴霧、粒子束電離、大氣壓化學(xué)電離（APCI）和電噴霧電離（ESI）技術(shù)對不同MS離子源條件下青霉素類藥物分子碎片類型的特征已經(jīng)作了大量的工作。另外離子阱質(zhì)譜技術(shù)（MS/MS）也已用于鑒別青霉素類藥物。如Straub等使用LC/ES/MS測定了牛奶中的幾種青霉素殘留。青霉素，鄰氯青霉素與芐青霉素的最低測定限為3～5μg/kg。Kihak 等以NCI方式的LC/PB/MS技術(shù)成功地對牛奶中OTC、TC與CTC殘留進(jìn)行確證，方法檢測限為0.02～0.05μg/mL。
2.3其它理化檢測方法：
牛奶中抗生素殘留檢測方法還有氣相色譜法（GC）、高效薄層色譜（HPTLC）、超臨界流體色譜（SFC）和毛細(xì)管區(qū)域電泳法（CZE）等。這些方法盡管在殘留檢測中不常用，但因其各自特有的性能，能彌補(bǔ)常用方法中不足之處。如GC有許多高靈敏、通用性或?qū)Ｒ恍詮?qiáng)的檢測器供選用，如氫焰離子化檢測器（FID）、氯磷檢測器（NPD）等，檢測限可達(dá)μg/kg級；HPTLC的斑點(diǎn)原位掃描定量、定性和高效分離材料（Φ3～10μm）改變了常規(guī)TLC在靈敏度和重現(xiàn)性方面的不足，但保持了TLC的簡便、快速和樣品容量大的優(yōu)點(diǎn)，可使用正相或反相板，分辨率幾乎與HPLC相當(dāng)，在抗生素殘留的快速篩選性檢測方面應(yīng)用廣泛；SFC可彌補(bǔ)GC和HPLC的不足，方便地連接各種靈敏的檢測器（MS，ECD等）；CZE是90年代以來研究最活躍的分析技術(shù)之一，兼有高壓電泳的高速、高分辨和HPLC靈活、高效的優(yōu)點(diǎn)，柱效高達(dá)105塔板／m。 Nishi等（1989，1990）使用CZE和MEKC成功地分離了十幾個(gè)β－內(nèi)酰胺類抗生素。CZE將在簡化樣本前處理、多殘留分析和分析自動(dòng)化方面發(fā)揮重要作用。目前CZE的主要問題是樣品量太小，限制了檢測的靈敏度。CZE－MS可能是最好的解決辦法。
此外，隨著接口技術(shù)的顯著改進(jìn)，質(zhì)譜作為一種質(zhì)量流速型檢測器，正廣泛應(yīng)用于殘留分析的檢測中。電化學(xué)檢測器也已用于檢測鄰氯青霉素、頭孢菌素和青霉素。
3、免疫法：
目前藥物殘留免疫分析技術(shù)主要分為兩大類：一為相對獨(dú)立的分析方法，即免疫測定法（immunoassays，IAs），如RIA、ELISA、固相免疫傳感器（soindphase immunosensor ）等；二是將免疫分析技術(shù)與常規(guī)理化分析技術(shù)聯(lián)用，如利用免疫分析的高選擇性作為理化測定技術(shù)中的凈化手段，典型的方式為免疫親合色譜（immunoaffinity chromatogrphy,IAC）。與常規(guī)的理化分析技術(shù)相比，免疫分析技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，速度快、分析成本低。以使用微量滴板的ELISA為例，免疫測定法取樣量小，前處理簡單、容量大，儀器化程度低，檢測奶與GC/MS或GC/ECD相似，可方便地達(dá)到ng/g～pg/g級，分析效率則為HPLC或GC的幾十倍以上。目前大部分抗生素已經(jīng)建立了免疫測定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、鏈霉素、四環(huán)素、莫能菌素等。
免疫分析能與其他技術(shù)聯(lián)用。在聯(lián)用方法中，免疫分析技術(shù)既可作為HPLC或GC等測定技術(shù)的樣品凈化或分離手段，如IAC/HPLIAC/GC、HOIAC/HPLC；也可作為其離線或在線檢測方法，如HPLC/IA、TLC/IA、CZE/IA、SFC/IA、FIA/IA等，這些方法結(jié)合了免疫分析的選擇性、靈敏度與HPLC、GC等技術(shù)的高速、高效分離和準(zhǔn)確檢測能力，使分析過程簡化、分析成本下降，拓展了待測物范圍。在HPLC/IA等分析中，IA一般作為離線檢測方法。又稱免疫圖譜法（immunograms），適用于液相檢測器無響應(yīng)或分離困難的殘留組分的檢測。FIA/IA可以實(shí)現(xiàn)IA的動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)和自動(dòng)檢測，分析速度快，已發(fā)展為一種專門的免疫測定技術(shù)－FIIA。
ELISA試劑盒是目前奶牛場和牛奶公司使用最廣泛、快速、靈敏的檢測抗生素殘留的方法。國外生產(chǎn)各類抗生素試劑盒成本較高，如德國拜發(fā)公司生產(chǎn)的抗生素檢測試劑盒，一個(gè)96次檢測試劑盒要花3800元，每個(gè)樣品的檢測要花50元左右。天邁生產(chǎn)的各類抗生素試劑盒相對來說成本較低，大約比進(jìn)口產(chǎn)品成本降低30-50%。